Mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist die Analyse eines breiten Spektrums an Substanzen möglich. In den 1960er Jahren aus der einfachen Säulenchromatographie geboren, entwickelte sich die HPLC stetig weiter. 2004 kamen schließlich die ersten UHPLC-Anlagen (bzw. UPLC-Anlagen der Firma Waters) auf den Markt, die die Flüssigkeitschromatographie noch einmal grundsätzlich veränderten.
Neben den technischen Voraussetzungen machte der Fortschritt auch vor den HPLC-Säulen nicht halt. Waren zu Beginn nur reine Silica-Phasen im Einsatz, sind inzwischen stationäre Phasen für die unterschiedlichsten Chromatographiemodi erhältlich. Dazu zählen Normalphasen-, Reversed Phase-, Ionenaustausch-, Größenausschluss- und Affinitätschromatographie. Vor allem die neueren Materialien sind zum Teil sehr spezifisch für entsprechende Aufgabenstellungen konzipiert. Zudem wurde, verglichen zu den Anfangszeiten der HPLC, die Qualität der stationären Phasen deutlich gesteigert.
Heute erhalten Sie HPLC-Säulen, die sich durch eine lange Lebensdauer und Robustheit auszeichnen. Dies ist auch sinnvoll, da HPLC-Säulen durchaus teuer in der Anschaffung sind. Neben der grundlegenden Qualität der Säulen gehört dazu allerdings auch eine entsprechende Pflege der stationären Phase.
Mobile Phasen:
Wir empfehlen die Verwendung von mobilen Phasen hoher Reinheit (HPLC-grade). Mobile Phasen geringerer Reinheit können Ihre Analytik durch enthaltene Verunreinigungen empfindlich stören. Mögliche Folgen sind das Auftreten von Geisterpeaks oder im schlechtesten Fall eine Änderung der Selektivität der Säule.
Bei der Verwendung von selbsthergestellten Pufferlösungen empfehlen wir i.d.R. zudem, diese vor ihrer Verwendung zu filtern. Für Säulen mit einer Partikelgröße > 5µm sollte die Porengröße des Filters 0,45 µm betragen, für Säulen mit kleinerer Partikelgröße 0,2 µm. In unserem Shop finden Sie eine große Auswahl an entsprechenden Filtermembranen.
Probenmatrix:
Die Lebensdauer einer HPLC-Säule hängt stark von der Beschaffenheit der zu untersuchenden Proben ab. Trinkwasserproben sind dabei z.B. weniger problematisch als komplexe Matrixproben wie z.B. Lebensmittel. Hier spielt die Präanalytik zur Aufreinigung der Probe eine wesentliche Rolle. Für eine effektive Probenvorbereitung erhalten Sie im Fachhandel ein breites Sortiment an Zubehör für z.B. Filtration oder Festphasenextraktion.
Für ein langes Säulenleben empfehlen wir Ihnen zusätzlich die Verwendung von inline-Filtern oder idealerweise Vorsäulen. Inline-Filter halten physikalisch Partikel, die aufgrund ihrer Größe nicht eluiert werden können, zurück. Eine Akkumulation am Säulenkopf wird so verhindert. Vorsäulen bieten den Vorteil, dass sie zusätzlich auch Moleküle, die eine irreversible Bindung mit dem Säulenmaterial eingehen würden, zurückhalten. Sowohl Filter als auch Vorsäulen sollten regelmäßig getauscht werden. Einen guten Hinweis auf den Zeitpunkt des Austausches gibt ein sukzessiver Anstieg des Rückdrucks.
Performance:
Wenn die Performance Ihrer HPLC-Säule mit der Zeit nachlässt, können Sie diese unter Umständen durch ein Spülprogramm regenerieren. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn die Einbußen der Trennleistung auf reversible Verunreinigungen der HPLC-Säule zurückzuführen sind.
Für das Spülprogramm gilt analog zur chromatographischen Trennung: Apolare Substanzen werden durch apolare Lösungsmittel eluiert, polare durch polare. Am einfachsten lässt sich das Spülen durch einen Gradienten mit polarem und apolarem Laufmittel umsetzen.
Je nach Art der Kontamination und des Säulenmaterials können Sie die Verunreinigungen auch durch Injektionen von verdünnten Säuren, Basen oder stark apolaren bzw. polaren Lösungsmitteln lösen.
Hilft das reguläre Spülen nicht weiter, können Sie die Säule versuchsweise auch entgegengesetzt der Flussrichtung spülen. Haben Sie eine UHPLC-Säule mit kleiner Partikelgröße, vergewissern Sie sich jedoch, ob dies möglich ist. Manche Säulen haben am Säuleneinlass eine gröbere Fritte als am Säulenauslass. Das Spülen in entgegengesetzter Richtung kann dann zu einem Austritt des Säulenmaterials führen.
Lagerung:
Für eine kurzfristige Lagerung können Sie das Laufmittel in der Säule belassen. Alternativ ist auch ein Durchlauf der mobilen Phase bei sehr niedrigem Fluss möglich. Für eine Lagerung über mehrere Tage empfehlen wir bei Einsatz eines pufferhaltigen Eluenten die Säule mit Wasser zu spülen, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern.
Möchten Sie HPLC-Säulen auf Silica-Basis längere Zeit lagern, so kann dies frei von Puffer in einem organischen Lösungsmittel (z.B. Acetonitril) mit maximal 50% Wasseranteil erfolgen. Enthielt das vorangegangene Fließmittel Puffer, empfehlen wir die Säule zuerst mit Wasser zu spülen, um ein mögliches Ausfallen der Puffersalze in dem organischen Lösungsmittel zu verhindern. Am einfachsten lagern Sie Ihre Säule jedoch in dem Lösungsmittel, indem Sie geliefert wurde. Dies gilt vor allem für stationäre Phasen auf Polymer-Basis. Je nach Material sind diese im Gegensatz zu den Silica-basierten mit organischen Lösungsmitteln nicht verträglich. Unabhängig von dem Säulenmaterial achten Sie auch darauf, dass die Säule fest verschlossen ist und nicht austrocknen kann. Unter diesen Bedingungen können Sie Ihre Säulen auch lange Zeit bei gleichbleibender Qualität lagern.
Zum Autor:
Die unabhängigen Produktexperten vom Analytics-Shop.com bilden seit Jahren eine optimale Anlaufstelle für Laborbedarf im Internet. Für unser Magazin haben Sie einige Tipps und Tricks für ein langes Säulenleben bei guter Trennleistung zusammengestellt.
(Analytics-Shop.com, 21.10.2013 – KSA)
